PRDM14 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404426-ACT

PRDM14 (proteina 14 con dita di zinco del dominio PR) è un regolatore trascrizionale specifico di sequenza che contribuisce a controllare i programmi di pluripotenza, la riprogrammazione epigenetica e l’espressione genica associata alle cellule germinali nelle cellule umane. Influenza lo stato della cromatina modulando i segni istonici e la dinamica della metilazione del DNA, coordinando reti trascrizionali che governano le decisioni sul destino cellulare e la differenziazione. L’attività di PRDM14 interseca vie che mantengono stati trascrizionali di tipo staminale e regolano l’impegno di linea, rendendola rilevante per studi di biologia dello sviluppo e riprogrammazione cellulare. Un’espressione deregolata di PRDM14 è stata collegata ad alterazioni dei circuiti trascrizionali e a squilibri epigenetici osservati in molteplici contesti tumorali, supportandone lo studio come nodo in programmi oncogenici associati alla “stemness”.

PRDM14 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di PRDM14 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

PRDM14 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus PRDM14 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione PRDM14, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di PRDM14. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus PRDM14 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da PRDM14 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via PRDM14 nelle cellule tumorali con espressione di PRDM14 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.