PPP1R12C Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-412332-ACT

PPP1R12C codifica MYPT3, una subunità regolatoria della fosfatasi della miosina che indirizza la protein fosfatasi 1 (PP1) verso la miosina II e substrati correlati, modulando la contrattilità actomiosinica. Modellando la dinamica di fosforilazione della catena leggera della miosina, PPP1R12C contribuisce all’organizzazione del citoscheletro, all’adesione cellulare, alla motilità e alle vie di meccanotrasduzione che influenzano l’architettura tissutale e la funzione di barriera. Un’alterata regolazione della defosforilazione dipendente da PP1 è stata associata a una migrazione cellulare disregolata e a segnali contrattili anomali, processi comunemente implicati nella biologia cardiovascolare e oncologica. In quanto nodo che collega il targeting della fosfatasi alla contrattilità guidata da RhoA/ROCK, PPP1R12C è rilevante per studi sulle reti di segnalazione della fosforilazione e su fenotipi dipendenti dal citoscheletro.

PPP1R12C Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di PPP1R12C senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

PPP1R12C Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus PPP1R12C nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione PPP1R12C, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di PPP1R12C. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus PPP1R12C nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da PPP1R12C nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via PPP1R12C nelle cellule tumorali con espressione di PPP1R12C silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.