PME-1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402446-ACT

Il gene umano **PPME1** codifica la **protein fosfatasi metilesterasi-1 (PME-1)**, un enzima che idrolizza il metilestere C-terminale delle subunità catalitiche di **PP2A** e, di conseguenza, modula l’assemblaggio dell’oloenzima PP2A, la sua localizzazione e la selezione dei substrati. Regolando lo stato di metilazione di PP2A, PME-1 influenza il controllo, dipendente dalla fosforilazione, della progressione del ciclo cellulare, della segnalazione del danno al DNA e delle vie di risposta allo stress, inclusi gli output delle reti **MAPK** e **PI3K/AKT**. Un’alterata regolazione di PP2A è ampiamente rilevante per i meccanismi di segnalazione chinasica aberrante e di proteostasi, frequentemente studiati in biologia del cancro e nella neurodegenerazione. PPME1 rappresenta quindi un nodo utile per analizzare come la modulazione fine delle fosfatasi rimodelli le dinamiche di segnalazione e i fenotipi cellulari in condizioni fisiologiche e associate alla malattia.

PME-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di PPME1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

PME-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus PPME1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione PPME1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di PME-1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus PPME1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da PME-1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via PME-1 nelle cellule tumorali con espressione di PPME1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.