PLAP Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400629-ACT

ALPP codifica la fosfatasi alcalina placentare (PLAP), un ectoenzima ancorato alla membrana tramite glicosilfosfatidilinositolo (GPI) che defosforila substrati extracellulari e contribuisce all’omeostasi del fosfato sulla superficie cellulare. L’attività della PLAP è associata all’organizzazione dei microdomini di membrana, alla modulazione della segnalazione purinergica tramite la defosforilazione dei nucleotidi e, più in generale, al controllo del metabolismo extracellulare dei fosfomonoesteri. Nei tessuti umani, ALPP è particolarmente espresso nella placenta ed è spesso utilizzato come marcatore associato alla differenziazione nella biologia del trofoblasto e in contesti legati alle cellule germinali. Un’espressione deregolata di ALPP/PLAP è stata riportata in molteplici contesti rilevanti per la patologia, a supporto della sua utilità nello studio dei programmi di linea cellulare, della funzione degli enzimi di superficie e degli stati di espressione associati ai tumori in modelli sperimentali.

PLAP Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di ALPP senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

PLAP Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus ALPP nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione ALPP, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di PLAP. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus ALPP nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da PLAP nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via PLAP nelle cellule tumorali con espressione di ALPP silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.