PKC gamma Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400503-ACT

PRKCG codifica la proteina chinasi C gamma (PKCγ), una serina/treonina chinasi convenzionale dipendente da Ca2+/diacilglicerolo, arricchita nei tessuti neuronali, che trasduce segnali a valle della fosfolipasi C e del turnover dei fosfoinositidi mediato dai recettori. PKCγ fosforila numerosi substrati per modulare la segnalazione sinaptica, la dinamica del citoscheletro e l’espressione genica dipendente dall’attività, integrando i segnali dei secondi messaggeri nelle reti MAPK/ERK e in altri circuiti chinasi. Nel sistema nervoso centrale, l’attività di PRKCG influenza la neurotrasmissione e la plasticità neuronale, e una sua regolazione alterata è stata associata a fenotipi neurodegenerativi e neuroevolutivi, incluse le atassie ereditarie. Queste proprietà rendono PRKCG un nodo utile per analizzare i meccanismi di trasduzione del segnale e il cross-talk tra vie di segnalazione in modelli cellulari e neuronali umani.

PKC gamma Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di PRKCG senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

PKC gamma Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus PRKCG nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione PRKCG, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di PKC gamma. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus PRKCG nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da PKC gamma nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via PKC gamma nelle cellule tumorali con espressione di PRKCG silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.