PKC beta Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400263-ACT

PRKCB codifica la protein chinasi C beta (PKCβ), una chinasi serina/treonina sensibile al diacilglicerolo e al Ca2+ che trasduce segnali provenienti da recettori accoppiati alla fosfolipasi C. Nelle cellule umane, PKCβ regola reti di fosforilazione che controllano la segnalazione NF-κB e MAPK, il rimodellamento del citoscheletro, il traffico vescicolare e le decisioni relative al ciclo cellulare e alla sopravvivenza. L’attività di PRKCB è strettamente legata alla segnalazione del recettore delle cellule B e dei recettori Fc e modella la produzione di mediatori infiammatori e le risposte allo stress ossidativo. Una segnalazione di PKCβ deregolata è stata implicata in un’attivazione immunitaria aberrante e in programmi di segnalazione oncogenici, rendendo PRKCB un nodo utile per studiare il rimodellamento delle vie chinasi dipendente dal contesto.

PKC beta Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di PRKCB senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

PKC beta Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus PRKCB nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione PRKCB, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di PKC beta. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus PRKCB nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da PKC beta nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via PKC beta nelle cellule tumorali con espressione di PRKCB silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.