PI 3-kinase p85α Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-422233-ACT

Pik3r1 codifica la subunità regolatoria p85α della fosfoinositide 3-chinasi (PI3K) di classe IA, che stabilizza e recluta le subunità catalitiche p110 verso recettori tirosin-chinasici attivati e proteine adattatrici. Attraverso il controllo della produzione di PI(3,4,5)P3, la PI 3-chinasi p85α modula la segnalazione AKT/mTOR per regolare crescita cellulare, metabolismo, sopravvivenza e segnalazione del recettore dell’insulina. Nei modelli murini, un’alterata attività di Pik3r1 influenza lo sviluppo e la funzione delle cellule immunitarie, l’omeostasi del glucosio e le risposte alla stimolazione con fattori di crescita. La segnalazione deregolata della via PI3K è ampiamente implicata in processi oncogenici e nei meccanismi delle malattie metaboliche, rendendo Pik3r1 un nodo chiave per l’analisi della via.

PI 3-kinase p85α Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Pik3r1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

PI 3-kinase p85α Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Pik3r1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Pik3r1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di PI 3-kinase p85α. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Pik3r1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da PI 3-kinase p85α nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via PI 3-kinase p85α nelle cellule tumorali con espressione di Pik3r1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.