PGAM5 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401300-ACT

PGAM5 (membro 5 della famiglia delle fosfoglicerato mutasi) è una fosfatasi mitocondriale atipica di serina/treonina, ancorata alla membrana mitocondriale esterna, che integra il controllo di qualità dei mitocondri con la segnalazione dello stress. Modula la dinamica mitocondriale e la mitofagia regolando eventi dipendenti dalla fosforilazione su substrati coinvolti nell’equilibrio fissione–fusione e può influenzare il turnover mitocondriale legato a PINK1/Parkin. PGAM5 interagisce inoltre con la segnalazione redox e con le vie di morte cellulare, incluse quelle associate alla necroptosi, modellando le risposte cellulari allo stress ossidativo e alle perturbazioni metaboliche. Un’attività o un’espressione deregolate di PGAM5 sono state associate a fenotipi di disfunzione mitocondriale implicati nella neurodegenerazione, nelle risposte cardiometaboliche allo stress e nella biologia del cancro, attraverso alterazioni della bioenergetica e dei programmi di adattamento allo stress.

PGAM5 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di PGAM5 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

PGAM5 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus PGAM5 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione PGAM5, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di PGAM5. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus PGAM5 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da PGAM5 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via PGAM5 nelle cellule tumorali con espressione di PGAM5 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.