PDX-1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400792-ACT

PDX1 codifica PDX-1, un fattore di trascrizione homeobox che coordina lo sviluppo del pancreas e mantiene l’identità delle cellule β mature regolando la trascrizione del gene dell’insulina e i programmi di differenziazione endocrina. Nelle cellule umane, PDX-1 integra i segnali sensibili ai nutrienti e ai fattori di crescita con le reti trascrizionali che controllano il rilevamento del glucosio, la capacità secretoria e le risposte allo stress cellulare. Un’attività di PDX-1 disregolata è associata a una compromissione della funzione delle cellule β e a un’alterata specificazione delle linee cellulari pancreatiche, rendendolo rilevante per lo studio dei meccanismi legati al diabete e della biologia dello sviluppo pancreatico. In quanto regolatore maestro, PDX-1 è spesso utilizzato per analizzare i circuiti trascrizionali che governano le decisioni di destino endocrino e l’omeostasi metabolica.

PDX-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di PDX1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

PDX-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus PDX1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione PDX1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di PDX-1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus PDX1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da PDX-1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via PDX-1 nelle cellule tumorali con espressione di PDX1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.