PDGF-B Plasmide di attivazione CRISPR (r): sc-437277-ACT

Il fattore di crescita derivato dalle piastrine, subunità B (PDGF-B), è un mitogeno secreto che segnala principalmente attraverso PDGFRβ per regolare il reclutamento, la proliferazione e la migrazione dei periciti e delle cellule muscolari lisce vascolari durante l’angiogenesi e il rimodellamento tissutale. La segnalazione PDGF-B–PDGFR attiva le vie MAPK/ERK, PI3K/AKT e PLCγ, coordinando la deposizione della matrice extracellulare, la chemiotassi e i programmi di riparazione delle ferite. Nei modelli di ratto, un’attività alterata di PDGF-B è comunemente associata a disfunzione vascolare, rimodellamento fibrotico e attivazione stromale aberrante, rendendolo un nodo utile per studiare l’integrità neurovascolare e il rimodellamento specifico d’organo. Una segnalazione di PDGF-B disregolata è inoltre rilevante in microambienti proliferativi e infiammatori, in cui le interazioni mesenchima–endotelio modellano l’architettura tissutale associata alla malattia.

PDGF-B Il plasmide di attivazione CRISPR (r) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

PDGF-B Il plasmide di attivazione CRISPR (r) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione , dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di PDGF-B. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da PDGF-B nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via PDGF-B nelle cellule tumorali con espressione di silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.