PDE4D Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-433646-ACT

Il gene murino **Pde4d** codifica la fosfodiesterasi 4D (PDE4D), una fosfodiesterasi specifica per il cAMP che idrolizza il cAMP in 5′-AMP e modella l’ampiezza e la compartimentalizzazione spaziale della segnalazione dipendente da PKA ed EPAC. Regolando il tono dei secondi messaggeri intracellulari, PDE4D influenza le risposte guidate dai GPCR, programmi trascrizionali come la segnalazione di CREB e processi quali proliferazione cellulare, differenziamento e modulazione immunitaria. L’attività di PDE4D è integrata con la segnalazione compartimentalizzata tramite le proteine di ancoraggio della chinasi A (AKAP) e può influenzare la dinamica della via MAPK/ERK attraverso il crosstalk con gli effettori del cAMP. Un turnover del cAMP mediato da PDE4D deregolato è stato implicato in fenomeni infiammatori e in fenotipi neurobiologici, a supporto del suo impiego come nodo meccanicistico in studi di segnalazione rilevanti per la patologia in modelli murini.

PDE4D Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Pde4d senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

PDE4D Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Pde4d nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Pde4d, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di PDE4D. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Pde4d nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da PDE4D nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via PDE4D nelle cellule tumorali con espressione di Pde4d silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.