PCPE-1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404359-ACT

PCOLCE codifica la proteina 1 potenziatrice dell’endopeptidasi C del procollagene (PCPE-1), una glicoproteina secreta della matrice extracellulare che potenzia l’elaborazione del procollagene fibrillare da parte di BMP1/metalloproteinasi tipo tolloide, aumentando il clivaggio del C-propeptide. Attraverso questa attività di cofattore, PCPE-1 supporta la maturazione del collagene, la deposizione della matrice e il rimodellamento tissutale, collegandosi all’organizzazione della matrice extracellulare e alla proteostasi nei tessuti connettivi. La funzione di PCPE-1 interseca le vie di biosintesi del collagene e di turnover della matrice che modellano l’architettura stromale e la segnalazione cellula–matrice. Un’alterata regolazione dell’espressione di PCOLCE e della lavorazione del collagene è stata associata al rimodellamento fibrotico e ad altre patologie caratterizzate da un accumulo anomalo di matrice extracellulare.

PCPE-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di PCOLCE senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

PCPE-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus PCOLCE nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione PCOLCE, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di PCPE-1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus PCOLCE nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da PCPE-1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via PCPE-1 nelle cellule tumorali con espressione di PCOLCE silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.