Pax-6 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-422119-ACT

Il Pax6 murino codifica il fattore di trascrizione Pax-6, un regolatore del legame al DNA con domini paired box/homeobox che coordina programmi di espressione genica necessari allo sviluppo dell’occhio, del prosencefalo e del comparto endocrino pancreatico. Pax-6 si integra con reti di segnalazione dello sviluppo, tra cui Wnt, Shh, BMP/TGF-β e Notch, per controllare la specificazione dei progenitori, l’impegno di linea e la differenziazione neuronale. Alterazioni del dosaggio di Pax6 o della sua attività regolatoria perturbano la patterning dello sviluppo e, nei sistemi modello, sono state associate a malformazioni oculari congenite, difetti del neurosviluppo e disfunzioni endocrine. In quanto regolatore maestro, Pax-6 è spesso utilizzato per studiare la logica cis‑regolatoria, le transizioni dello stato della cromatina e i circuiti trascrizionali alla base delle decisioni di destino cellulare.

Pax-6 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Pax6 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Pax-6 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Pax6 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Pax6, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Pax-6. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Pax6 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Pax-6 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Pax-6 nelle cellule tumorali con espressione di Pax6 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.