patched/PTCH1 Plasmide Double Nickase (m): sc-422471-NIC

Ptch1 codifica il recettore patched (PTCH1) del topo, una proteina transmembrana a 12 passaggi che funge da principale inibitore di Smoothened nella via di segnalazione Hedgehog. Il legame dei ligandi Hedgehog, come SHH, allevia la repressione mediata da PTCH1, consentendo l’attivazione a valle dei programmi trascrizionali dipendenti da GLI che regolano il patterning embrionale, il comportamento delle cellule staminali e progenitrici e l’omeostasi tissutale. L’alterazione del controllo della segnalazione dipendente da PTCH1 è associata a un’attivazione aberrante della via Hedgehog ed è ampiamente studiata nei disordini dello sviluppo e nella biologia dei tumori. Ptch1 rappresenta quindi un nodo chiave per investigare la trasduzione del segnale associata alle ciglia, i gradienti di morfogeni e la regolazione trascrizionale durante lo sviluppo e nella modellizzazione delle malattie nei sistemi murini.

patched/PTCH1 Il plasmide Double Nickase (m) consiste in una coppia di plasmidi ingegnerizzati per l'editing ad alta specificità del locus Ptch1 nelle linee cellulari mouse. Ciascun plasmide esprime una nickasi Cas9 D10A e un sgRNA distinto che prende di mira filamenti di DNA opposti all'interno di Ptch1. Quando indirizzate verso siti adiacenti su filamenti di DNA opposti, le due nickasi generano tagli a filamento singolo sfalsati che insieme producono una rottura a doppio filamento sfalsata, richiedendo un'attività coordinata sul bersaglio da entrambe le guide. La rottura del DNA risultante viene risolta da vie di riparazione cellulare endogene, più comunemente attraverso la giunzione non omologa delle estremità (NHEJ), portando a inserzioni o delezioni che interrompono la funzione di Ptch1. Richiedendo il coinvolgimento di due sgRNA nel locus bersaglio, l'approccio a doppia nickasi migliora la specificità dell'editing e fornisce una strategia CRISPR complementare per applicazioni in cui è desiderato un controllo aggiuntivo sulla precisione del targeting.

Per supportare l'identificazione efficiente delle cellule modificate, un plasmide codifica la GFP per la visualizzazione fluorescente delle popolazioni trasfettate, mentre il plasmide di accompagnamento porta un gene di resistenza alla puromicina per la selezione antibiotica. Insieme, queste caratteristiche supportano l'arricchimento efficiente delle popolazioni co-trasfettate e semplificano la convalida dei cloni con Ptch1 interrotto.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.