PA200 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404513-ACT

PSME4 codifica PA200, un attivatore del proteasoma che si associa alla particella core 20S per modulare l’apertura del gate del proteasoma e il processamento dei peptidi. PA200 è coinvolto nella degradazione proteasomiale indipendente dall’ubiquitina ed è spesso associato alla proteostasi nucleare, inclusa la regolazione del turnover di proteine associate alla cromatina durante le risposte al danno al DNA e i processi legati alla spermatogenesi. Modellando l’attività del proteasoma, PA200 può influenzare vie che controllano la progressione del ciclo cellulare, la stabilità del genoma e il rimodellamento adattativo del proteoma in condizioni di stress. Un’alterata espressione di PSME4 è stata riportata in molteplici contesti patologici in cui risultano compromesse la proteostasi e la riparazione del DNA, sostenendone lo studio come nodo meccanicistico nel controllo di qualità delle proteine e nella segnalazione nucleare dello stress.

PA200 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di PSME4 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

PA200 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus PSME4 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione PSME4, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di PA200. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus PSME4 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da PA200 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via PA200 nelle cellule tumorali con espressione di PSME4 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.