P2X7 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-422093-ACT

Il gene murino **P2rx7** codifica il recettore **P2X7**, un canale cationico attivato dall’ATP, altamente espresso nelle cellule immunitarie e gliali, che collega i segnali extracellulari di pericolo all’ingresso di Ca²⁺/Na⁺, all’efflusso di K⁺ e alla formazione di pori di membrana in condizioni di stimolazione prolungata. P2X7 è un importante regolatore a monte della segnalazione dell’inflammasoma, promuovendo l’attivazione di NLRP3 e la maturazione di IL‑1β/IL‑18; inoltre influenza l’attività delle fosfolipasi, le vie MAPK/NF‑κB e i programmi di morte cellulare. Attraverso questi meccanismi, P2rx7 contribuisce alla regolazione del rilascio di citochine, delle risposte antimicrobiche dei fagociti e della comunicazione neuro‑immunitaria. Un’alterazione della segnalazione di P2X7 è stata associata, in modelli preclinici, a fenotipi infiammatori e neuroinfiammatori, a ipersensibilità al dolore e all’immunoregolazione del microambiente tumorale, a supporto della sua utilità in studi mirati sulle vie di segnalazione.

P2X7 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di P2rx7 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

P2X7 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus P2rx7 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione P2rx7, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di P2X7. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus P2rx7 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da P2X7 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via P2X7 nelle cellule tumorali con espressione di P2rx7 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.