P2X7 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400780-ACT

Il gene umano **P2RX7** codifica il canale ionico P2X7 attivato dall’ATP, un recettore purinergico trimerico che regola il flusso di cationi, la depolarizzazione di membrana e la formazione prolungata di pori nelle cellule immunitarie e gliali. La segnalazione di P2X7 collega il rilevamento dell’ATP extracellulare all’attivazione dell’inflammasoma, al rilascio di citochine e a programmi di morte cellulare regolata, integrandosi con le vie infiammatorie mediate da NF-κB, MAPK e NLRP3. Un’attività alterata di P2X7 è stata associata a neuroinfiammazione dis-regolata, stati infiammatori cronici e rimodellamento del microambiente tumorale–immunitario, rendendolo un nodo utile per lo studio dell’infiammazione sterile e della segnalazione da stress. In quanto recettore di superficie con marcati readout funzionali, P2RX7 viene spesso analizzato in modelli di attivazione dei macrofagi, risposte della microglia e dinamiche della segnalazione purinergica.

P2X7 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di P2RX7 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

P2X7 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus P2RX7 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione P2RX7, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di P2X7. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus P2RX7 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da P2X7 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via P2X7 nelle cellule tumorali con espressione di P2RX7 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.