OTC Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402611-ACT

L’ornitina transcarbamilasi (OTC) è un enzima mitocondriale che catalizza la conversione di ornitina e carbamoil fosfato in citrullina, una tappa fondamentale del ciclo dell’urea epatico responsabile della detossificazione dell’ammoniaca. Regolando l’eliminazione dell’azoto, l’attività di OTC influenza il bilancio azotato cellulare, il metabolismo mitocondriale e l’omeostasi degli amminoacidi, con effetti a valle sullo stress ossidativo e sullo stato bioenergetico. La deregolazione di OTC è associata all’iperammoniemia e agli errori congeniti del metabolismo, e le alterazioni del flusso del ciclo dell’urea sono state studiate in contesti di rimodellamento metabolico e disfunzione mitocondriale. OTC umano rappresenta quindi un nodo utile per analizzare il controllo del ciclo dell’urea, la gestione dell’azoto e le risposte allo stress associate ai mitocondri in epatociti e in sistemi modello rilevanti per il fegato.

OTC Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di OTC senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

OTC Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus OTC nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione OTC, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di OTC. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus OTC nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da OTC nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via OTC nelle cellule tumorali con espressione di OTC silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.