Olfr303 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-434741-ACT

Olfr303 codifica un recettore olfattivo murino appartenente alla superfamiglia dei GPCR di classe A, tipo rodopsina, tipicamente espresso nei neuroni sensoriali olfattivi, dove contribuisce al rilevamento degli odoranti e alla trasduzione del segnale. Dopo il legame con il ligando, i recettori olfattivi si accoppiano a vie mediate da proteine G che promuovono la produzione di cAMP, l’attività dei canali a nucleotidi ciclici, la depolarizzazione di membrana e programmi trascrizionali a valle coinvolti nell’attività neuronale e nell’adattamento sensoriale. Oltre all’olfatto, è stata riportata un’espressione ectopica dei recettori olfattivi in tessuti diversi, stimolando studi sulla regolazione del segnale cellulare, sulla differenziazione e sul sensing del microambiente mediati dai GPCR. La deregolazione della segnalazione dei GPCR è ampiamente rilevante per la neurobiologia e la biologia del cancro, rendendo Olfr303 un modello utile per interrogare stati di segnalazione guidati dal recettore nei sistemi murini.

Olfr303 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Olfr303 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Olfr303 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Olfr303 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Olfr303, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Olfr303. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Olfr303 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Olfr303 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Olfr303 nelle cellule tumorali con espressione di Olfr303 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.