Olfr291 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-434560-ACT

Olfr291 codifica un recettore olfattivo nel topo che appartiene alla superfamiglia dei recettori accoppiati a proteine G (GPCR) di classe A ed è tipicamente associato ai neuroni sensoriali dell’epitelio olfattivo. In seguito al legame con il ligando, i recettori olfattivi si accoppiano alla segnalazione mediata da proteine G, che stimola l’adenilato ciclasi, aumenta i livelli di cAMP e modula l’attività dei canali ionici regolati da nucleotidi ciclici, influenzando l’eccitabilità neuronale e le risposte evocate dagli odori. Oltre alla biologia sensoriale, è stata riportata l’espressione ectopica di recettori olfattivi (per sottoinsiemi di recettori) in diversi tessuti, a supporto di studi sulla trasduzione del segnale legata ai GPCR, sui programmi trascrizionali e sulla regolazione dello stato cellulare in contesti non canonici. Olfr291 è quindi rilevante per studi sulla codifica chemosensoriale, sulla dinamica delle vie dei GPCR e sui meccanismi tramite cui variazioni nell’espressione recettoriale possono associarsi a fenotipi cellulari alterati in modelli di malattia.

Olfr291 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Olfr291 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Olfr291 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Olfr291 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Olfr291, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Olfr291. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Olfr291 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Olfr291 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Olfr291 nelle cellule tumorali con espressione di Olfr291 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.