OLFML3 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404425-ACT

OLFML3 (olfactomedin-like 3) codifica una glicoproteina secreta associata alla matrice extracellulare (ECM), implicata nel rimodellamento del microambiente tissutale e nella regolazione delle interazioni cellula–matrice. Nelle cellule umane, OLFML3 è stata collegata a vie che governano la segnalazione angiogenica, l’adesione cellulare e il crosstalk tra stroma e sistema immunitario, con ruoli riportati nello sviluppo vascolare e nell’organizzazione della matrice extracellulare. Un’alterata espressione di OLFML3 è stata osservata in molteplici contesti patologici, inclusi lo stroma associato al cancro e condizioni infiammatorie, a supporto della sua utilità come nodo meccanicistico per lo studio di fenotipi guidati dal microambiente. La modulazione sperimentale di OLFML3 è quindi rilevante per indagare come i regolatori secreti della ECM influenzino la migrazione, il comportamento endoteliale e le reti di segnalazione in colture complesse e sistemi di co-coltura.

OLFML3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di OLFML3 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

OLFML3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus OLFML3 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione OLFML3, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di OLFML3. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus OLFML3 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da OLFML3 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via OLFML3 nelle cellule tumorali con espressione di OLFML3 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.