Oct-6 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401826-ACT

POU3F1 (Oct-6) codifica un fattore di trascrizione con dominio POU che regola la specificazione di linea e i programmi di differenziamento, con ruoli di rilievo nelle cellule derivate dalla cresta neurale e nello sviluppo delle cellule di Schwann. Oct-6 modula reti trascrizionali che controllano l’uscita dal ciclo cellulare, l’espressione di geni associati alla mielinizzazione e la tempistica dello sviluppo, attraverso il legame a promotori/enhancer e la cooperazione con altri regolatori trascrizionali. Un’attività deregolata di POU3F1 è stata collegata a stati di differenziamento aberranti e a una capacità proliferativa alterata, rendendolo rilevante per lo studio delle vie neuro-sviluppative, della biologia della glia e della plasticità cellulare guidata da fattori di trascrizione. Nei modelli cellulari umani, Oct-6 funge da nodo per interrogare i circuiti di regolazione genica alla base delle decisioni di destino cellulare e della trascrizione in risposta allo stress.

Oct-6 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di POU3F1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Oct-6 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus POU3F1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione POU3F1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Oct-6. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus POU3F1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Oct-6 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Oct-6 nelle cellule tumorali con espressione di POU3F1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.