Nur77 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-420884-ACT

Nr4a1 codifica il recettore nucleare orfano Nur77 (NR4A1), un fattore di trascrizione “immediate-early” rapidamente indotto da stimoli diversi, tra cui la segnalazione del recettore dell’antigene, le citochine e lo stress cellulare. Nur77 modula reti geniche che controllano l’attivazione e la tolleranza delle cellule T, i programmi infiammatori dei macrofagi, l’adattamento metabolico e l’apoptosi, integrando segnali provenienti dalle vie MAPK, NF-κB e calcio-dipendenti. Nei modelli murini, un’attività alterata di Nr4a1 è stata associata a una regolazione anomala dell’omeostasi immunitaria, infiammazione cronica e fenotipi vascolari e metabolici, rendendolo un nodo ampiamente utilizzato per studiare il controllo trascrizionale responsivo agli stimoli. I suoi ruoli dipendenti dal contesto nelle decisioni sul destino cellulare supportano inoltre studi meccanicistici su oncogenesi, risposte al danno tissutale e plasticità trascrizionale guidata dal microambiente.

Nur77 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Nr4a1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Nur77 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Nr4a1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Nr4a1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Nur77. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Nr4a1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Nur77 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Nur77 nelle cellule tumorali con espressione di Nr4a1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.