NT-3 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401458-ACT

La neurotrofina 3 (NTF3) codifica la neurotrofina secreta NT-3, un regolatore chiave della sopravvivenza neuronale, della crescita dei neuriti e della maturazione sinaptica durante lo sviluppo e nel mantenimento dei tessuti adulti. NT-3 segnala principalmente attraverso NTRK3/TrkC per attivare le vie MAPK/ERK, PI3K–AKT e PLCγ, integrando il supporto trofico con la plasticità dipendente dall’attività e con programmi di differenziamento. Al di là del sistema nervoso, la segnalazione dipendente da NTF3 influenza la guida assonale, la funzione dei neuroni sensoriali e le interazioni neuro-immunitarie tramite la modulazione dell’espressione genica e della dinamica del citoscheletro. Una segnalazione delle neurotrofine deregolata, inclusa un’alterata attività dell’asse NT-3/TrkC, è stata associata a fenotipi di neurosviluppo e a meccanismi rilevanti per la neurodegenerazione e la biologia del dolore neuropatico.

NT-3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di NTF3 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

NT-3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus NTF3 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione NTF3, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di NT-3. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus NTF3 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da NT-3 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via NT-3 nelle cellule tumorali con espressione di NTF3 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.