Nox4 Plasmide di attivazione CRISPR (r): sc-437338-ACT

La NADPH ossidasi 4 (Nox4) è un flavocitocromo associato alla membrana che genera specie reattive dell’ossigeno, principalmente perossido di idrogeno, come parte di una segnalazione redox regolata nelle cellule di ratto. Le ROS derivate da Nox4 influenzano vie che controllano proliferazione, differenziamento, rimodellamento del citoscheletro e turnover della matrice extracellulare, con effetti a valle sulla segnalazione MAPK, sulle risposte al TGF-β e sui programmi trascrizionali associati all’ipossia. Alterazioni dell’attività di NOX4 sono state collegate a fenotipi di stress ossidativo rilevanti per fibrosi, disfunzione vascolare, danno renale e segnalazione infiammatoria, rendendola un bersaglio utile per studi meccanicistici del rimodellamento cellulare redox-dipendente. Poiché in alcuni contesti NOX4 può essere costitutivamente attiva, la modulazione della sua espressione è spesso utilizzata per chiarire come una produzione sostenuta di ROS rimodelli le reti di segnalazione.

Nox4 Il plasmide di attivazione CRISPR (r) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Nox4 Il plasmide di attivazione CRISPR (r) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione , dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Nox4. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Nox4 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Nox4 nelle cellule tumorali con espressione di silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.