nephrocystin-2 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403310-ACT

INVS codifica la nefrocistina-2 (inversina), una proteina associata alle ciglia che si localizza nelle ciglia primarie e nei corpi basali e contribuisce all’organizzazione del centrosoma e alla segnalazione ciliare. La nefrocistina-2 partecipa alla polarità planare delle cellule e modula gli output della via Wnt, sostenendo l’equilibrio tra la segnalazione canonica mediata da β-catenina e la segnalazione non canonica durante la morfogenesi dei tessuti. L’alterazione di INVS compromette la meccanosensazione dipendente dalle ciglia e la polarità epiteliale, processi centrali per lo sviluppo e l’omeostasi dei tubuli renali. Le varianti genetiche in INVS sono associate a fenotipi da ciliopatia, inclusi disturbi dello spettro della nefronoftisi e difetti di lateralità, rendendolo un bersaglio utile per studiare le reti di segnalazione guidate dalle ciglia nelle cellule umane.

nephrocystin-2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di INVS senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

nephrocystin-2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus INVS nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione INVS, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di nephrocystin-2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus INVS nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da nephrocystin-2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via nephrocystin-2 nelle cellule tumorali con espressione di INVS silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.