MafB Plasmide di attivazione CRISPR (m2): sc-421335-ACT-2

Nel topo, Mafb codifica il fattore di trascrizione MafB, una proteina a “basic leucine zipper” che regola la specificazione di linea e la differenziazione terminale di macrofagi/monociti, cellule endocrine pancreatiche e podociti renali in sviluppo, attraverso il controllo sequenza-specifico dell’espressione genica. MafB agisce all’interno di programmi trascrizionali ed epigenetici a valle di vie di segnalazione dello sviluppo e immunitarie, influenzando la polarizzazione dei macrofagi, le reti responsivi alle citochine e il mantenimento della struttura dei podociti e dell’integrità della barriera di filtrazione. Un’attività di Mafb deregolata è stata associata ad alterazioni dell’omeostasi immunitaria e a difetti dell’organogenesi, e le variazioni di espressione di MafB vengono spesso analizzate in modelli di danno glomerulare, disfunzione delle isole pancreatiche associata al diabete e stress infiammatorio. L’editing genetico di Mafb nel topo consente studi meccanicistici dei circuiti trascrizionali, delle decisioni di destino cellulare e della patologia tessuto-specifica utilizzando modelli in vivo, cellule primarie e sistemi di cellule staminali differenziate.

MafB Il plasmide di attivazione CRISPR (m2) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Mafb senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

MafB Il plasmide di attivazione CRISPR (m2) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Mafb nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Mafb, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di MafB. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Mafb nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da MafB nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via MafB nelle cellule tumorali con espressione di Mafb silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.