Lsh Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-420828-ACT

Mouse Hells codifica l’elicasi specifica dei linfociti (Lsh), un rimodellatore della cromatina dipendente da ATP della famiglia SNF2 che regola il posizionamento dei nucleosomi, la struttura della cromatina di ordine superiore e i pattern di metilazione del DNA a livello genomico. Lsh supporta il mantenimento del silenziamento epigenetico degli elementi ripetitivi e influenza i programmi trascrizionali durante lo sviluppo, la differenziazione e la progressione del ciclo cellulare attraverso il controllo dell’accessibilità della cromatina. È funzionalmente collegata a vie che governano la formazione dell’eterocromatina, l’assemblaggio della cromatina accoppiato alla replicazione e la repressione degli elementi trasponibili, contribuendo così alla stabilità del genoma. La disregolazione del rimodellamento epigenetico associato a HELLS/Lsh è stata implicata in paesaggi di metilazione aberranti e in fenotipi di instabilità cromosomica rilevanti per la biologia del cancro e la ricerca sul neurosviluppo.

Lsh Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Hells senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Lsh Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Hells nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Hells, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Lsh. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Hells nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Lsh nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Lsh nelle cellule tumorali con espressione di Hells silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.