LRWD1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-405341-ACT

LRWD1 (leucine-rich repeats and WD repeat domain containing 1), noto anche come ORCA, è un fattore associato alla cromatina implicato nella “licenza” della replicazione del DNA attraverso interazioni con componenti del complesso di riconoscimento dell’origine e del complesso di pre-replicazione. Contribuisce al corretto innesco delle origini e alla progressione della fase S supportando il caricamento e la stabilizzazione dei fattori di replicazione sulle origini replicative, collegando lo stato della cromatina alla duplicazione del genoma. LRWD1 è stato inoltre associato all’organizzazione dell’eterocromatina e al mantenimento della stabilità genomica, processi che influenzano il controllo del ciclo cellulare e le risposte allo stress replicativo. Alterazioni dell’espressione o della funzione di LRWD1 sono state riportate in contesti di disregolazione proliferativa, rendendolo rilevante per studi su tempi di replicazione, regolazione della cromatina e biologia delle malattie associate all’instabilità genomica.

LRWD1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di LRWD1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

LRWD1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus LRWD1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione LRWD1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di LRWD1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus LRWD1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da LRWD1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via LRWD1 nelle cellule tumorali con espressione di LRWD1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.