LRCH4 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-433102-ACT

Il gene murino *Lrch4* codifica LRCH4, una proteina contenente ripetizioni ricche in leucina e un dominio di omologia con la calponina, che si ritiene funzioni da adattatore del citoscheletro collegando moduli di interazione proteina–proteina alle dinamiche associate all’actina. Le proteine della famiglia LRCH sono state implicate nella regolazione della forma cellulare, dell’adesione e della motilità, processi che influenzano il rimodellamento dei tessuti e il comportamento delle cellule immunitarie. Nei sistemi dei mammiferi, LRCH4 è stata collegata a reti di segnalazione dell’immunità innata, incluse vie che interagiscono con risposte dipendenti dai recettori Toll-like e con programmi trascrizionali infiammatori. Un’alterata regolazione di LRCH4 è stata quindi studiata nel contesto di fenotipi infiammatori e di disregolazioni immunitarie rilevanti negli studi su modelli di malattia.

LRCH4 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Lrch4 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

LRCH4 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Lrch4 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Lrch4, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di LRCH4. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Lrch4 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da LRCH4 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via LRCH4 nelle cellule tumorali con espressione di Lrch4 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.