LOXL1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401965-ACT

LOXL1 codifica la lisil ossidasi–like 1, un’ammino ossidasi secreta e rame-dipendente che catalizza la deaminazione ossidativa dei residui di lisina nel collagene e nell’elastina, consentendo la reticolazione covalente e la stabilizzazione dell’architettura della matrice extracellulare. Regolando l’assemblaggio delle fibre elastiche e il rimodellamento della matrice, LOXL1 influenza la meccanica dei tessuti, la segnalazione cellula–matrice e processi quali la fibrosi e la riparazione delle ferite. Un’attività alterata di LOXL1 è stata associata a patologie del tessuto connettivo e a disturbi della matrice extracellulare oculare, incluso un aumento del rischio di sindrome da pseudoesfoliazione/glaucoma, ed è studiata nel contesto dell’integrità del tessuto vascolare e del pavimento pelvico. In quanto enzima che modifica la matrice, LOXL1 rappresenta un nodo utile per analizzare l’omeostasi della ECM, la meccanobiologia e i fenotipi di malattia guidati dal rimodellamento in modelli cellulari umani.

LOXL1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di LOXL1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

LOXL1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus LOXL1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione LOXL1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di LOXL1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus LOXL1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da LOXL1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via LOXL1 nelle cellule tumorali con espressione di LOXL1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.