LIMP II Particelle di Attivazione Lentivirale (h): sc-402532-LAC

SCARB2 codifica la proteina integrale di membrana lisosomiale 2 (LIMP II), una glicoproteina multipasso di membrana arricchita su endosomi tardivi e lisosomi, che supporta il traffico endolisosomiale e l’omeostasi dei lisosomi. LIMP II agisce come recettore chiave per il trasporto della β‑glucocerebrosidasi (GCase) ai lisosomi, collegando la funzione di SCARB2 al metabolismo degli sfingolipidi e alla proteostasi all’interno della via autofagia–lisosoma. Attraverso i suoi ruoli nell’organizzazione della membrana e nel trasporto del carico, SCARB2 influenza processi quali l’endocitosi, lo smistamento degli enzimi lisosomiali e la degradazione delle macromolecole. Un’alterata attività di SCARB2/LIMP II è stata associata a fenotipi di accumulo lisosomiale e a stress cellulare correlato alla neurodegenerazione, rendendolo un bersaglio rilevante per studi meccanicistici della disfunzione lisosomiale e del catabolismo lipidico.

Le particelle di attivazione lentivirale LIMP II (h) rispondono a questa esigenza incapsulando il sistema completo di attivazione trascrizionale del mediatore di attivazione sinergica (SAM) in particelle lentivirali ad alto titolo pronte per la trasduzione, consentendo un'efficiente sovraregolazione di SCARB2 in una gamma più ampia di tipi di cellule umane.

Le particelle di attivazione lentivirale LIMP II (h) veicolano tutti i componenti funzionali del sistema del mediatore di attivazione sinergica (SAM) tramite trasduzione lentivirale. Il sistema comprende tre preparati di particelle co-trasdotti nelle cellule bersaglio: uno che codifica per dCas9 cataliticamente inattivo (mutazioni D10A e N863A) fuso al dominio di transattivazione VP64 con un gene di resistenza alla blasticidina; una che codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1 con un gene di resistenza all'igromicina; e una che codifica un sgRNA di 20 nt specifico per il bersaglio fuso a due aptameri di RNA MS2 con un gene di resistenza alla puromicina. A seguito della trasduzione lentivirale e dell'integrazione genomica dei cassetti di espressione, i componenti del SAM vengono espressi in modo stabile e si assemblano nel locus bersaglio all'interno della regione promotrice prossimale a monte del sito di inizio della trascrizione SCARB2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo cooperativo per reclutare il machinery trascrizionale endogeno e guidare una sovraregolazione sostenuta dell'espressione endogena di LIMP II. L'uso di dCas9 inattivo nei confronti delle nucleasi evita l'introduzione di rotture del DNA a doppio filamento e preserva il locus genomico nativo SCARB2 e l'architettura regolatoria.

Il formato lentivirale offre diversi vantaggi pratici: l'integrazione genomica stabile supporta l'attivazione ereditaria attraverso le divisioni cellulari; le preparazioni di particelle ad alto titolo eliminano la necessità di una produzione virale interna; e la compatibilità con tipi di cellule primarie, non in divisione e resistenti alla trasfezione amplia l'accessibilità sperimentale. Il successo della trasduzione può essere confermato e potenziato attraverso una selezione antibiotica tripla utilizzando puromicina, igromicina e blasticidina.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.