KV1.4 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-405990-ACT

KCNA4 codifica il canale del potassio umano voltaggio-dipendente KV1.4, una subunità α correlata a Shaker che si assembla in canali tetramerici per mediare correnti di tipo A di K⁺ a rapida inattivazione. Modellando la ripolarizzazione del potenziale d’azione, gli intervalli tra scariche e l’eccitabilità sinaptica, KV1.4 contribuisce al controllo attività-dipendente del potenziale di membrana nei tessuti eccitabili. La disponibilità del canale e il gating sono regolati dalla fosforilazione e da interazioni proteina–proteina che influenzano il traffico e la stabilità sulla superficie cellulare, collegando KCNA4 a processi di segnalazione più ampi che modulano l’eccitabilità neuronale e cardiaca. Un’alterazione dell’equilibrio delle correnti della famiglia KV1 è stata associata a fenotipi di segnalazione elettrica disregolata, rilevanti per studi su meccanismi aritmogeni, suscettibilità alle crisi epilettiche e disturbi dell’eccitabilità in sistemi modello.

KV1.4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di KCNA4 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

KV1.4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus KCNA4 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione KCNA4, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di KV1.4. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus KCNA4 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da KV1.4 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via KV1.4 nelle cellule tumorali con espressione di KCNA4 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.