Ksr-1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401768-ACT

Il gene umano **KSR1** codifica **Ksr-1**, una proteina scaffold che coordina **RAF**, **MEK** ed **ERK** per modulare l’ampiezza e la durata della segnalazione **MAPK/ERK**. Organizzando complessi di chinasi in specifici siti subcellulari, Ksr-1 influenza la proliferazione responsiva ai fattori di crescita, la differenziazione, la progressione del ciclo cellulare e i programmi di sopravvivenza. La modulazione dell’output della via ERK dipendente da KSR1 interseca i meccanismi di controllo a feedback, gli input dei recettori tirosin-chinasici e i nodi di segnalazione responsivi allo stress. L’attività deregolata della via MAPK che coinvolge KSR1 è stata studiata nel contesto della segnalazione oncogenica, di fenotipi invasivi e di un’alterata plasticità cellulare, a supporto della sua rilevanza per studi meccanicistici in biologia del cancro e nella trasduzione del segnale.

Ksr-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di KSR1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Ksr-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus KSR1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione KSR1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Ksr-1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus KSR1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Ksr-1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Ksr-1 nelle cellule tumorali con espressione di KSR1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.