KIR2.1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401974-ACT

KCNJ2 codifica la subunità del canale del potassio a rettificazione entrante KIR2.1, un determinante chiave del potenziale di membrana a riposo e della ripolarizzazione del potenziale d’azione nelle cellule eccitabili. Conducendo correnti IK1, KIR2.1 stabilizza l’eccitabilità di membrana e modella il comportamento elettrofisiologico nel muscolo cardiaco e scheletrico, integrandosi con le vie dell’omeostasi ionica che accoppiano il voltaggio di membrana alla gestione del calcio e alla contrattilità. La disregolazione dell’attività o dell’espressione di KCNJ2 è associata a fenotipi aritmici ereditari e a disfunzioni neuromuscolari, rendendolo un bersaglio rilevante per studi meccanicistici sulle canalopatie e sulla segnalazione elettrica. In vitro, la modulazione dei livelli di KIR2.1 è comunemente utilizzata per indagare programmi trascrizionali dipendenti dal potenziale di membrana, soglie di eccitabilità e interazioni tra reti di canali ionici.

KIR2.1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di KCNJ2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

KIR2.1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus KCNJ2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione KCNJ2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di KIR2.1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus KCNJ2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da KIR2.1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via KIR2.1 nelle cellule tumorali con espressione di KCNJ2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.