KCC2 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402080-ACT

Il gene umano **SLC12A5** codifica per il cotrasportatore **K+/Cl−** specifico dei neuroni **KCC2**, un regolatore chiave dell’omeostasi intracellulare del cloruro che determina la polarità e l’efficacia della neurotrasmissione GABAergica e glicinergica. Accoppiando l’estrusione di K+ e Cl−, KCC2 sostiene la segnalazione sinaptica inibitoria, la maturazione neuronale e la plasticità dipendente dall’attività, e interagisce con processi del citoscheletro e del traffico intracellulare che ne controllano la localizzazione di membrana. Alterazioni dell’espressione o della funzione di KCC2 sono state associate a uno squilibrio tra eccitazione e inibizione e a ipereccitabilità di rete in molteplici contesti di patologie del neurosviluppo e neurologiche. Di conseguenza, SLC12A5 è ampiamente studiato nei pathway che regolano l’inibizione sinaptica, la differenziazione neuronale e la stabilità dei circuiti.

KCC2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di SLC12A5 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

KCC2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus SLC12A5 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione SLC12A5, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di KCC2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus SLC12A5 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da KCC2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via KCC2 nelle cellule tumorali con espressione di SLC12A5 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.