ITPase Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-421191-ACT

Itpa del topo codifica l’inosina trifosfato pirofosfatasi (ITPasi), un enzima citosolico “housekeeping” che idrolizza trifosfati purinici non canonici come ITP e dITP per impedirne l’accumulo. Sanificando il pool di nucleotidi, l’ITPasi supporta la fedeltà della replicazione, l’integrità di DNA/RNA e i processi di mantenimento del genoma, strettamente legati alle risposte cellulari allo stress. L’alterazione dell’omeostasi del pool nucleotidico può aumentare gli eventi di misincorporazione ed elevare la segnalazione di danno al DNA, collegando la funzione di ITPA a vie che influenzano la mutagenesi e le cascate di segnalazione infiammatoria. Un’attività di ITPA modificata è quindi rilevante per modelli di instabilità genomica e fenotipi associati al metabolismo nei sistemi murini.

ITPase Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Itpa senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

ITPase Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Itpa nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Itpa, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di ITPase. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Itpa nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da ITPase nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via ITPase nelle cellule tumorali con espressione di Itpa silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.