Plasmide CRISPR d'Activation (m) ITPase: sc-421191-ACT

Le gène murin *Itpa* code l’inosine triphosphate pyrophosphatase (ITPase), une enzyme cytosolique « d’entretien » qui hydrolyse des triphosphates puriques non canoniques tels que l’ITP et le dITP afin d’empêcher leur accumulation. En assainissant le pool de nucléotides, l’ITPase soutient la fidélité de la réplication, l’intégrité de l’ADN/de l’ARN et les processus de maintien du génome, étroitement liés aux réponses cellulaires au stress. Une perturbation de l’homéostasie du pool de nucléotides peut accroître les événements de mésincorporation et renforcer la signalisation des dommages à l’ADN, reliant ainsi la fonction d’ITPA à des voies influençant la mutagenèse et des cascades de signalisation inflammatoire. Une activité ITPA altérée est donc pertinente dans des modèles d’instabilité génomique et de phénotypes associés au métabolisme dans les systèmes murins.

ITPase Le plasmide d'activation CRISPR (m) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de Itpa sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

ITPase Le plasmide d'activation CRISPR (m) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus Itpa dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription Itpa, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de ITPase. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus Itpa natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de ITPase au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie ITPase dans les cellules tumorales présentant une expression de Itpa silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.