Islet-1 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-421157-ACT

Mouse Isl1 codifica Islet-1, un fattore di trascrizione LIM-homeodomain che coordina la specificazione del destino cellulare e i programmi di differenziamento durante l’embriogenesi. Islet-1 regola reti geniche coinvolte nello sviluppo endocrino del pancreas, nella formazione dei motoneuroni e nella biologia dei progenitori cardiaci, integrandosi con vie di segnalazione dello sviluppo per controllare l’impegno di linea e la maturazione. Un’attività di ISL1 deregolata è stata associata, nei sistemi modello, ad alterazioni dell’identità e della funzione delle cellule β, a difetti del neurosviluppo che interessano i circuiti motori e a fenotipi cardiaci congeniti, rendendolo un nodo utile per studiare il controllo trascrizionale dell’organogenesi. Come marcatore di linea e di progenitori, Islet-1 è spesso utilizzato per mappare le traiettorie di sviluppo e per interrogare gli elementi regolatori che plasmano l’espressione genica specifica di tessuto.

Islet-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Isl1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Islet-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Isl1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Isl1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Islet-1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Isl1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Islet-1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Islet-1 nelle cellule tumorali con espressione di Isl1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.