ILDR1 Plasmide di attivazione CRISPR (m2): sc-430649-ACT-2

Il gene murino Ildr1 codifica il recettore 1 contenente un dominio di tipo immunoglobulinico (ILDR1), una proteina transmembrana a singolo passaggio arricchita nelle tight junction tricellulari, dove contribuisce a organizzare l’architettura della barriera epiteliale e a regolare la permeabilità paracellulare. ILDR1 partecipa all’assemblaggio delle giunzioni e a processi di segnalazione legati alla polarità apico-basolaterale e al traffico delle proteine di membrana, sostenendo un’adesione cellula-cellula coordinata nei tessuti sensoriali ed epiteliali. L’alterazione della funzione di ILDR1 è associata a difetti delle tight junction e a fisiopatologia uditiva, rendendo Ildr1 un bersaglio rilevante per lo studio dei meccanismi della perdita dell’udito e della disfunzione della barriera epiteliale. L’editing genetico di Ildr1 nel topo consente di interrogare in vivo e in vitro la biologia delle giunzioni tricellulari, la regolazione della barriera in modo tessuto-specifico e i cambiamenti trascrittomici o proteomici a valle in modelli di sviluppo dell’epitelio sensoriale e di risposte allo stress rilevanti per la malattia.

ILDR1 Il plasmide di attivazione CRISPR (m2) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Ildr1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

ILDR1 Il plasmide di attivazione CRISPR (m2) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Ildr1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Ildr1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di ILDR1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Ildr1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da ILDR1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via ILDR1 nelle cellule tumorali con espressione di Ildr1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.