IL-28B Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-406651-ACT

L’IFNL3 umano codifica l’interferone lambda 3 (IL-28B), un interferone di tipo III che segnala attraverso il complesso recettoriale IFNLR1/IL10RB per attivare le vie JAK–STAT e indurre i geni stimolati dagli interferoni (ISG), che modellano le difese antivirali intrinseche nelle superfici epiteliali e di barriera. I programmi trascrizionali guidati da IL-28B regolano il rilevamento immunitario innato, la presentazione dell’antigene e il tono infiammatorio, intersecandosi con le reti mediate da STAT1/STAT2–IRF9 (ISGF3) e da IRF. Le variazioni nell’espressione di IFNL3 sono state associate a diverse risposte dell’ospite all’infezione virale e all’infiammazione immunomediata, rendendolo un nodo utile per studiare il crosstalk tra citochine e la regolazione delle vie dell’interferone. Nei modelli cellulari, la modulazione di IFNL3 consente di interrogare la segnalazione immunitaria epiteliale, i meccanismi di restrizione virale e la dinamica a valle degli ISG senza alterare direttamente i componenti del patogeno.

IL-28B Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di IFNL3 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

IL-28B Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus IFNL3 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione IFNL3, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di IL-28B. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus IFNL3 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da IL-28B nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via IL-28B nelle cellule tumorali con espressione di IFNL3 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.