IKK-ε Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401786-ACT

IKBKE codifica IKK-ε, una chinasi di IκB non canonica che integra il riconoscimento dell’immunità innata con programmi trascrizionali infiammatori. IKK-ε fosforila intermedi chiave della segnalazione favorendo l’attivazione di IRF3/IRF7 e l’espressione genica dipendente da NF-κB, modulando le risposte dell’interferone di tipo I e la produzione di citochine. Attraverso un crosstalk con le vie a valle dei TLR, dei recettori simili a RIG-I e di STING, IKK-ε influenza le difese antivirali, la sopravvivenza cellulare e la segnalazione legata allo stress metabolico. Un’attività deregolata di IKBKE è stata associata a stati infiammatori persistenti ed è stata studiata nel contesto delle reti di segnalazione associate ai tumori e del rimodellamento del microambiente immunitario.

IKK-ε Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di IKBKE senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

IKK-ε Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus IKBKE nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione IKBKE, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di IKK-ε. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus IKBKE nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da IKK-ε nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via IKK-ε nelle cellule tumorali con espressione di IKBKE silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.