IFT20 Particelle di Attivazione Lentivirale (h): sc-418576-LAC

IFT20 (trasporto intraflagellare 20) è un componente fondamentale del macchinario di trasporto intraflagellare, necessario per l’assemblaggio e il mantenimento del ciglio primario, e supporta la segnalazione dipendente dalle ciglia e il traffico polarizzato. Oltre al suo ruolo ciliare, IFT20 si localizza al Golgi e partecipa allo smistamento delle vescicole e alla consegna di proteine di membrana al ciglio e alla sinapsi immunitaria, collegandosi così all’organizzazione dei recettori e alla trasduzione del segnale. Attraverso queste funzioni, IFT20 influenza vie come la segnalazione Hedgehog e altri processi di sviluppo e omeostatici mediati dalle ciglia. Un trasporto ciliare disregolato e l’alterazione della funzione del complesso IFT sono ampiamente associati a fenotipi legati alle ciliopatie e sono rilevanti anche per studi sul controllo del ciclo cellulare, la differenziazione e la morfogenesi dei tessuti.

Le particelle di attivazione lentivirale IFT20 (h) rispondono a questa esigenza incapsulando il sistema completo di attivazione trascrizionale del mediatore di attivazione sinergica (SAM) in particelle lentivirali ad alto titolo pronte per la trasduzione, consentendo un'efficiente sovraregolazione di IFT20 in una gamma più ampia di tipi di cellule umane.

Le particelle di attivazione lentivirale IFT20 (h) veicolano tutti i componenti funzionali del sistema del mediatore di attivazione sinergica (SAM) tramite trasduzione lentivirale. Il sistema comprende tre preparati di particelle co-trasdotti nelle cellule bersaglio: uno che codifica per dCas9 cataliticamente inattivo (mutazioni D10A e N863A) fuso al dominio di transattivazione VP64 con un gene di resistenza alla blasticidina; una che codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1 con un gene di resistenza all'igromicina; e una che codifica un sgRNA di 20 nt specifico per il bersaglio fuso a due aptameri di RNA MS2 con un gene di resistenza alla puromicina. A seguito della trasduzione lentivirale e dell'integrazione genomica dei cassetti di espressione, i componenti del SAM vengono espressi in modo stabile e si assemblano nel locus bersaglio all'interno della regione promotrice prossimale a monte del sito di inizio della trascrizione IFT20, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo cooperativo per reclutare il machinery trascrizionale endogeno e guidare una sovraregolazione sostenuta dell'espressione endogena di IFT20. L'uso di dCas9 inattivo nei confronti delle nucleasi evita l'introduzione di rotture del DNA a doppio filamento e preserva il locus genomico nativo IFT20 e l'architettura regolatoria.

Il formato lentivirale offre diversi vantaggi pratici: l'integrazione genomica stabile supporta l'attivazione ereditaria attraverso le divisioni cellulari; le preparazioni di particelle ad alto titolo eliminano la necessità di una produzione virale interna; e la compatibilità con tipi di cellule primarie, non in divisione e resistenti alla trasfezione amplia l'accessibilità sperimentale. Il successo della trasduzione può essere confermato e potenziato attraverso una selezione antibiotica tripla utilizzando puromicina, igromicina e blasticidina.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.