IDH1 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-421022-ACT

Il gene murino *Idh1* codifica l’isocitrato deidrogenasi 1 (IDH1) citosolica, un enzima NADP+-dipendente che catalizza la decarbossilazione ossidativa dell’isocitrato ad α-chetoglutarato, generando al contempo NADPH. Mantenendo le riserve di NADPH, IDH1 supporta i sistemi redox glutatione/tioredossina, la biosintesi lipidica e le risposte cellulari allo stress ossidativo. L’attività di IDH1 collega il metabolismo centrale del carbonio con vie epigenetiche e di sensing dell’ossigeno attraverso la disponibilità di α-chetoglutarato per le diossigenasi, influenzando la demetilazione di DNA/istoni e la segnalazione dell’ipossia. La disregolazione del metabolismo dipendente da IDH1 è rilevante per studi sul rimodellamento metabolico oncogenico, sullo squilibrio redox e sui cambiamenti di stato di linea in tessuti proliferativi e in differenziamento.

IDH1 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Idh1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

IDH1 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Idh1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Idh1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di IDH1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Idh1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da IDH1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via IDH1 nelle cellule tumorali con espressione di Idh1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.