ICSBP Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400774-ACT

L’IRF8 umano codifica l’interferon consensus sequence-binding protein (ICSBP), un fattore di trascrizione con espressione ristretta alle cellule ematopoietiche che coopera con partner delle famiglie IRF ed ETS per regolare la specificazione delle linee mieloidi e delle cellule B, la presentazione dell’antigene e i programmi genici stimolati dagli interferoni. ICSBP integra segnali provenienti dalle vie dell’interferone, dei TLR e delle citochine per plasmare le risposte immunitarie innate e adattative, inclusi l’attivazione dei macrofagi e la differenziazione delle cellule dendritiche. Un’attività disregolata di IRF8 è stata associata ad alterazioni dello sviluppo delle cellule immunitarie, a fenotipi infiammatori e a una maggiore suscettibilità a disturbi immunomediati, ed è frequentemente studiata nel contesto della biologia delle neoplasie ematologiche. In quanto regolatore nodale di reti trascrizionali, IRF8 rappresenta un punto di accesso gestibile per analizzare i circuiti di regolazione genica che controllano l’omeostasi immunitaria.

ICSBP Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di IRF8 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

ICSBP Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus IRF8 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione IRF8, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di ICSBP. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus IRF8 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da ICSBP nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via ICSBP nelle cellule tumorali con espressione di IRF8 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.