Huntingtin Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401441-ACT

HTT codifica huntingtina, una grande proteina citoplasmatica e nucleare che sostiene l’omeostasi neuronale attraverso ruoli nel traffico vescicolare, nell’endocitosi, nell’autofagia e nel trasporto dipendente dai microtubuli. La huntingtina influenza inoltre la regolazione trascrizionale e la funzione sinaptica coordinando reti di interazioni proteina‑proteina e fungendo da impalcatura per complessi di segnalazione. Nelle cellule umane, HTT contribuisce alle vie di risposta allo stress e di proteostasi, collegando la funzione mitocondriale e l’eliminazione selettiva dei carichi ai programmi cellulari di sopravvivenza. La disregolazione della biologia della huntingtina, inclusi cambiamenti nella proteostasi e nel controllo trascrizionale, è ampiamente utilizzata come modello per studiare le alterazioni dei pathway associate alla neurodegenerazione.

Huntingtin Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di HTT senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Huntingtin Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus HTT nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione HTT, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Huntingtin. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus HTT nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Huntingtin nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Huntingtin nelle cellule tumorali con espressione di HTT silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.