HSP70-2 CRISPR Activationプラスミド (h): sc-417733-ACT

HSPA1Bは誘導性シャペロンであるHSP70-2をコードしており、プロテオトキシックなストレス下でプロテオスタシスを維持する細胞の熱ショック応答の中核要素です。HSP70-2は、新生タンパク質や誤って折りたたまれたタンパク質に露出した疎水性領域に結合し、再フォールディングを促進するとともに、凝集を防ぎ、ユビキチン–プロテアソーム系およびオートファジーを介した「再フォールディングか分解か」の選別判断を支援します。共シャペロンや熱ショック因子シグナルと協調することで、HSP70-2はアポトーシス、炎症シグナル、ならびに酸化ストレス・熱ストレス・ER関連ストレスからの回復にも影響を与えます。HSP70ネットワーク活性の変化は、腫瘍細胞の生存、神経変性、ストレス誘発性の細胞毒性に関連する表現型と結び付けられており、HSPA1Bはストレス適応の機構研究に有用なノードとなります。

HSP70-2 CRISPR活性化プラスミド（h）は、基盤となるDNA配列を変更することなく、内因性HSPA1Bの発現を標的化し、非破壊的にアップレギュレートするアプローチを提供します。

HSP70-2 CRISPR 活性化プラスミド (h) は、ヒト細胞株における HSPA1B 遺伝子座の高効率かつ部位特異的な転写アップレギュレーションのために設計された、3 つのプラスミドからなる相乗的活性化メディエーター (SAM) システムです。このシステムは、DNA結合能を維持しつつヌクレアーゼ活性を失わせる2つの不活性化変異（D10AおよびN863A）を有する、触媒活性のないCas9（dCas9）を中核としています。このdCas9は、強力な転写活性化因子であるVP64と融合しており、選別用のブラスティシジン耐性遺伝子と共に共発現します。2番目のプラスミドは、dCas9-VP64と協調して機能する二次活性化複合体であるMS2-p65-HSF1融合タンパク質をコードしており、ヒグロマイシン耐性遺伝子と共に発現する。3番目のプラスミドは、標的特異的な20塩基対のsgRNAをコードしており、これはMS2-p65-HSF1複合体を活性化部位に誘導する2つのMS2 RNAアプタマーと融合しており、さらにピューロマイシン耐性遺伝子が付随している。これら3つのプラスミドは、システム構成要素すべてが均等に発現するよう、質量比1:1:1で導入される。

標的遺伝子座に集合すると、SAM複合体はHSPA1B転写開始点の上流約200 bpの領域に結合し、そこでVP64、p65、およびHSF1が協調して転写装置を動員し、内因性HSP70-2の発現上昇を促進する。ヌクレアーゼ活性を持つCas9とは異なり、 dCas9は二本鎖切断を導入したりゲノム配列を改変したりしないため、天然のHSPA1B遺伝子座が保持され、内因性遺伝子座におけるHSP70-2依存性の転写応答の研究が可能となります。これにより、機能解析、標的遺伝子の同定、およびHSPA1B発現が沈黙または低下した腫瘍細胞におけるHSP70-2経路の回復のモデル化を行う上で、貴重なツールとなります。

研究用のみ。診断用または治療用ではありません。