HSP70-2 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-417733-ACT

HSPA1B codifica lo chaperone inducibile HSP70-2, un componente centrale della risposta cellulare allo shock termico che preserva la proteostasi durante lo stress proteotossico. HSP70-2 si lega alle regioni idrofobiche esposte delle proteine nascenti o mal ripiegate per favorirne il ripiegamento, prevenire l’aggregazione e facilitare le decisioni di smistamento tra ripiegamento e degradazione tramite il sistema ubiquitina–proteasoma e l’autofagia. Coordinandosi con i co-chaperoni e con la segnalazione del fattore dello shock termico, HSP70-2 influenza l’apoptosi, la segnalazione infiammatoria e il recupero da stress ossidativo, termico e associato al reticolo endoplasmatico (RE). Alterazioni dell’attività della rete HSP70 sono state associate a fenotipi rilevanti per la sopravvivenza delle cellule tumorali, la neurodegenerazione e la citotossicità indotta da stress, rendendo HSPA1B un nodo utile per studi meccanicistici dell’adattamento allo stress.

HSP70-2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di HSPA1B senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

HSP70-2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus HSPA1B nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione HSPA1B, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di HSP70-2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus HSPA1B nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da HSP70-2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via HSP70-2 nelle cellule tumorali con espressione di HSPA1B silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.