HSP 20 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403164-ACT

HSPB6 codifica la piccola proteina da shock termico HSP20, uno chaperone molecolare inducibile dallo stress che modula il ripiegamento proteico, la dinamica del citoscheletro e la proteostasi. Nelle cellule muscolari lisce e in diversi tipi cellulari cardiovascolari, HSP20 partecipa a programmi di segnalazione collegati alle vie cAMP/PKA e ossido nitrico–cGMP, con effetti dipendenti dalla fosforilazione sul rimodellamento dell’actina e sul tono contrattile. HSP20 interagisce inoltre con le risposte all’apoptosi e allo stress ossidativo, influenzando la sopravvivenza cellulare in condizioni proteotossiche e infiammatorie. Una deregolazione dell’espressione o della segnalazione di HSPB6 è stata associata ad alterata reattività vascolare, adattamento dei cardiomiociti allo stress e disfunzione della muscolatura liscia, rendendola rilevante per studi meccanicistici della biologia cardiovascolare e delle vie aeree.

HSP 20 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di HSPB6 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

HSP 20 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus HSPB6 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione HSPB6, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di HSP 20. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus HSPB6 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da HSP 20 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via HSP 20 nelle cellule tumorali con espressione di HSPB6 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.