HoxA1 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-420899-ACT

Hoxa1 codifica il fattore di trascrizione omeobox HoxA1, un regolatore precoce dello sviluppo che contribuisce a stabilire la polarità antero-posteriore e l’identità posizionale durante l’embriogenesi. HoxA1 agisce in programmi trascrizionali che coordinano la segmentazione del rombencefalo, la migrazione delle cellule della cresta neurale e l’organogenesi, integrandosi con la regolazione più ampia della rete HOX e con input di segnalazione quali l’espressione genica dipendente dall’acido retinoico. Nei modelli murini, un’alterazione dell’attività di Hoxa1 compromette la normale morfogenesi e le decisioni di destino cellulare, rendendolo rilevante per lo studio dei difetti dello sviluppo e dei circuiti di regolazione genica. In quanto fattore di legame al DNA specifico di sequenza, HoxA1 rappresenta un nodo facilmente interrogabile per analizzare come i fattori di trascrizione dello sviluppo rimodellino la cromatina e gli output delle vie a valle.

HoxA1 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Hoxa1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

HoxA1 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Hoxa1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Hoxa1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di HoxA1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Hoxa1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da HoxA1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via HoxA1 nelle cellule tumorali con espressione di Hoxa1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.