HMGCR Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400560-ACT

HMGCR codifica la 3-idrossi-3-metilglutaril-CoA reduttasi, un enzima di membrana del reticolo endoplasmatico (RE) che catalizza la conversione limitante la velocità di HMG-CoA in mevalonato nella via di biosintesi del colesterolo. Controllando il flusso di mevalonato, HMGCR influenza la produzione a valle di steroli e isoprenoidi che sostiene la biogenesi delle membrane, la prenilazione delle proteine e una più ampia omeostasi metabolica. La sua attività è strettamente regolata dalla trascrizione dipendente da SREBP, dal feedback basato sul “sensing” degli steroli e dalla degradazione associata al RE, collegando lo stato nutrizionale alla sintesi lipidica. Un’espressione o un’attività di via di HMGCR deregolata è spesso oggetto di studio nell’ipercolesterolemia, nei meccanismi legati all’aterosclerosi, nella sindrome metabolica e negli stati proliferativi in cui la dipendenza dalla via del mevalonato può modellare i fenotipi cellulari.

HMGCR Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di HMGCR senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

HMGCR Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus HMGCR nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione HMGCR, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di HMGCR. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus HMGCR nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da HMGCR nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via HMGCR nelle cellule tumorali con espressione di HMGCR silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.