HM74 Plasmídeo de ativação de CRISPR (m): sc-429832-ACT

O gene murino Hcar2 codifica o HM74 (também conhecido como GPR109A), um receptor acoplado à proteína G (GPCR) associado a Gi/o que reconhece metabólitos como o ácido nicotínico e o corpo cetônico β-hidroxibutirato. A sinalização de HM74 suprime a atividade da adenilato ciclase e modula programas a jusante dependentes de cAMP, influenciando o metabolismo lipídico, o estado energético celular e a produção de mediadores inflamatórios. Em contextos imunes e epiteliais, a atividade de Hcar2 cruza-se com a sinalização da imunidade inata e com a homeostase de barreira, moldando respostas de citocinas e o comportamento de leucócitos. Vias Hcar2/HM74 desreguladas são frequentemente estudadas em modelos de estresse metabólico, inflamação do tecido adiposo e imunometabolismo ligado ao microbioma.

HM74 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de Hcar2 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

HM74 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus Hcar2 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição Hcar2, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de HM74. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus Hcar2 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de HM74 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via HM74 em células tumorais com expressão de Hcar2 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.